Afinite Ajanlarının Aspergillus oryzae'de Üretim Platformunun Oluşturulması

---

Tezin Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Bezmiâlem Vakıf Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyoteknoloji, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2023

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: ELİF KARAMAN

Danışman: Serdar Uysal

Özet:

Biyoteknolojik uygulama alanlarında afinite ajanı olarak kullanılan monoklonal antikorlar(mAbs)’ın yüksek verimde heterolog olarak ifadelenmeleri; fonksiyonellik için üç boyutlu katlanma ve çözünürlük özelliklerinde karşılaşılan problemler ve/veya maliyetli üretim yöntemlerine ihtiyaç duyulması nedeniyle sınırlanmaktadır. Tek domainli ağır zincir antikorlar(VHH) ise, mAbs’e kıyasla önemli üstünlüklere sahip ve yalnızca tek bir ağır zincirden oluşması sebebiyle daha küçük boyuttaki, eşsiz antikor parçalarıdır. VHH’ler küçük boyutu, düşük immünojenikliği ve yüksek çözünürlüğü ile dikkat çekici afinite ajanları olarak, tanı, tedavi ve görüntüleme teknikleri dahil olmak üzere pek çok biyoteknolojik uygulamada mAbs’nin yerlerini almaya başlamıştır.

Aspergillus oryzae (A. oryzae), uzun yıllardır fermentasyon teknolojisinde ve biyoteknolojik ürünlerin endüstriyel ölçekte üretiminde tercih edilen ve Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından Genel Olarak Güvenli (GRAS) statüsü verilmiş olan ipliksi fungidir. Taksonomik olarak kendisine en yakın Aspergillus türleri ile kıyaslandığında, A. oryzae genomunda özellikle hidrolitik enzimleri kodlayan genler bakımından daha fazla gene sahiptir. Bu güçlü salgılama mekanizması A. oryzae’i afinite ajanlarının büyük ölçekte ve güvenilir olarak üretimi için ideal bir platform haline getirmektedir.

Bu tez çalışmasında, pyrG geni bakımından oksotrof haline getirilen A. oryzae’nin konak mikroorganizma olarak kullanıldığı biyoteknolojik bir platformun inşa edilmesi ve inşa edilen bu ifadelenme platformunun afinite ajanlarının üretiminde kullanılabileceğinin kanıtlanması gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla afinite ajanı olarak seçilen ribonükleik asit A (RNaz A)’ya karşı spesifik olan anti-RNaz A VHH proteininin, küçük ölçekte ve fermentör düzeyinde üretilerek saflaştırılmasının sağlanmıştır. Anti-RNaz A VHH’in, hedef antijeni olan RNaz A ile spesifik etkileşiminin belirlenmesinde; pull-down analizi, jel filtrasyon kromatografi analizi ve yüzey plazmon rezonans (SPR) analizi gerçekleştirilmiştir. Pull-down analizi spesifik etkileşimin varlığını gösterirken, jel filtrasyon kromatografi analizi ifadelenen anti-RNaz A VHH’in hedef antijeni ile bağlanabilen doğru üç boyutlu katlanma yapısında olduğunu kanıtlamıştır. SPR analizinde ise hedef antijen ile bağlanma afinitesi 1.9 nM olarak ölçülmüştür. Ölçülen bağlanma afinitesi, Escherichia coli (E. coli)’de üretilen anti-RNaz A VHH’in bağlanma afinitesinden yaklaşık 18.3 kat daha fazladır.

Elde edilen veriler, kurulan pyrG oksotrof A. oryzae platformunda, anti-RNaz A VHH afinite ajanının büyük ölçekte ve yüksek bağlanma afinitesi ile doğru üç boyutlu formda ve monomerik olarak üretilerek, başarılı bir şekilde saflaştırıldığını ortaya koymaktadır.

Buradan hareketle tez kapsamında varılan sonuçlar; çeşitli biyoteknolojik uygulama ve araştırma çalışmalarında ihtiyaç duyulan yüksek hacimde ve hedef antijenine yüksek bağlanma afinitesi gösteren VHH afinite ajanlarının, düşük maliyetle ifadelenmesinde, tez kapsamında inşa edilen pyrG oksotrof A. oryzae ifadelenme sisteminin, güçlü salgılama yeteneği sayesinde ideal bir platform olduğunu kanıtlar niteliktedir.