Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2019
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: HURİ BULUT
Danışman: Abdürrahim Koçyiğit
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:
Farklı endüstrilerde geniş bir kullanım alanına sahip olan enzimler, hastalıkların
tanısında kullanılan biyokimyasal analizler için de önemlidir. Format (formik asit) tek
karbonlu endojen bir metabolit olup, insan serumunda ve idrarında belirli seviyelerde
bulunur. Format düzeylerinin insan serumu ve idrarında özellikle metanol
intoksikasyonu, vitamin B eksiklikleri, astım ve çeşitli psikiyatrik bozukluklar ve
farklı maddelerin metabolizmasına bağlı olarak arttığı gösterilmiştir. Format
Dehidrojenaz (FDH), format için mutlak özgüllük gösteren ve ortamda bulunan
formattan elektronları NAD+'ye transfer eden bir enzimdir. Reaksiyonun sonunda
oluşan NADH + H miktarı, reaksiyona giren formatın miktarı ile doğru orantılıdır. Tez
projesi ile amacımız, NAD+ bağımlı FDH enzimininin rekombinant DNA teknolojisi
ile üretilmesi, enzim aktivitesinin ve termal stabilitesinin arttırılmasıdır.
Çalışmamızda, Candida boidinii (Cbo) FDH proteinini kodlayan 1095 baz çift geni,
bir şablon olarak kullanılarak Polimez Zincir Reaksiyonu (PZR) ile çoğaltıldı. Ürün
pET-23b (+) ifade vektörüne klonlandıktan sonra ekspresyon için Escherichia coli
(E.coli) BL21 (DE3) hücrelerine transfer edildi. Üretilen CboFDH enziminin
saflaştırılması için afinite His-Trap kolonu kullanıldı. Enzim aktivitesi ölçümleri 340
nm'de NADH miktarının fotometrik ölçümü ile gerçekleştirildi. Moleküller arası
etkileşimler üzerinde yapılan mutasyonların etkisini tahmin etmek için, Gaussian 09
yazılımına mevcut kristal yapı (PDB: 5DN9) tanıtıldı ve mutasyon yapılacak bölgeler
tahmin edildi. Daha sonra, enzim aktivitesini ve termal stabilitesini arttırmaya yönelik
olarak Val120Thr, Phe285Thr, Gln287Glu, His311Gln ve Phe285Thr/His311Gln
mutasyonları gerçekleştirildi. Mutasyonla aminoasitleri değiştirilmiş enzimin yapısı
geometrik optimizasyon ile kendi ortamında gerçek forma en yakın şekilde
modellendi. Sonuçlar Pymol paket yazılımı ile görselleştirilerek tartışıldı. Hem
yabanıl tip hem de mutant FDH'ler için kinetik ve termostabilite çalışmaları yapıldı.
Çalışmada ayrıca, yabanıl tip FDH ve mutant FDH suşlarının enzim aktivitesi üzerinde
farklı metal iyonlarının ve çözücülerin etkisi araştırıldı. Yabanıl tip ve mutant
enzimlerin ikincil yapıları ve termal stabilite çalışmaları CD (Circular Dichroism)
spektroskopisi ile incelendi.
Çalışma sonucunda rekombinant DNA teknolojisi ile üretilen yabanıl tip CboFDH için
uygun pH 7.4, optimum sıcaklık ise 40 °C bulunurken; mutant enzimler için optimum
pH ve sıcaklıklar, Phe285ThrFDH için pH 7,sıcaklık 40 °C , Val120ThrFDH için pH
7, sıcaklık 40 °C , Gln287GluFDH için pH 7, sıcaklık 60 °C , His311GlnFDH için pH
7, sıcaklık 65 °C ve Phe285Thr/His311GlnFDH için pH 8, sıcaklık 64 °C olarak
bulundu. CD cihazı ile α-heliks ikincil yapıları belirlenen yabanıl tip ve mutant
xviii
: 21
Aralı
enzimlerin Tm değerleri yabanıl tip CboFDH için 64 °C , Gln287GluFDH için 70 °C ,
His311GlnFDH için 77 °C ve Phe285Thr/His311GlnFDH için 73 °C olarak saptandı.
Enzim kinetiği çalışmaları ile yabanıl tip CboFDH için format için KM değeri 2 mM
ve Kcat değeri 948 x 107 S-1,NAD için KM değeri 1.5 mM ve Kcat değeri 262 x 106 S-
1; Phe285ThrFDH için format için KM değeri 0.97 mM ve Kcat değeri 623 x 106 S-
1,NAD için KM değeri 2.3 mM ve Kcat değeri 459 x 106 S-1; Val120ThrFDH için format
için KM değeri 1.3 mM ve Kcat değeri 623 x 106 S-1, NAD için KM değeri 7.9 mM ve
Kcat değeri 104 x 107 S-1; Gln287GluFDH için format için KM değeri 1.95 mM ve
Kcat değeri 442 x 107 S-1, NAD için KM değeri 3.3 mM ve Kcat değeri 951 x 106 S-1;
His311GlnFDH için format için KM değeri 1.5 mM ve Kcat değeri 328 x 107 S-1, NAD
için KM değeri 1.6 mM, Kcat değeri 820 x 106 S-1; Phe285Thr/His311GlnFDH için
format için KM değeri 1.4 mM ve Kcat değeri 695 x 107 S-1, NAD için KM değeri 7
mM, Kcat değeri 121 x 108 S-1olarak hesaplandı.
Farklı konsantrasyonlardaki 12 farklı metalin enzim aktivitesine etkisi sonuçlarında
yabanıl tip CboFDH için CuCl2 harici tüm metallerin aktiviteyi arttırdığı gözlenirken
CuCl2'ün artan konsantrasyonlarda %30'a kadar aktiviteyi düşürdüğü; ayrıca KCl2,
MnCl2 ve Tungsten'in aktiviteyi %50'nin üzerinde arttırdığı bulundu. Mutant
enzimlerden Phe285ThrFDH enzimi için CaCl2, NaCl, MnCl ve MgSo4'ün artan
konsantrayonlarda aktiviteyi %50'nin üzerinde arttırdığı, CuCl2'ün artan
konsantrasyonlarda aktiviteyi %77'ye kadar azalttığı; Val120ThrFDH enzimi için
CaCl2'ün artan konsantrasyonlarda aktiviteyi %50'nin üzerinde arttırdığı CuCl2'ün
artan konsantrasyonlarda aktiviteyi %26'ya kadar azalttığı; Gln287GluFDH enzimi
için MnCl'ün artan konsantrasyonlarda aktiviteyi %50'nin üzerinde arttırdığı CuCl2'ün
artan konsantrasyonlarda aktiviteyi %39'a kadar azalttığı; His311GlnFDH enzimi için
KCl2,MnCl ve Tungsten'in artan konsantrasyonlarda aktiviteyi %50'nin üzerinde
arttırdığı CuCl2'ün artan konsantrasyonlarda aktiviteyi %26'a kadar azalttığı;
Phe285Thr/His311GlnFDH enzimi için CaCl2, MnCl ve ZnCl'ün artan
konsantrasyonlarda aktiviteyi %50'nin üzerinde arttırdığı CuCl2'ün artan
konsantrasyonlarda aktiviteyi %45'e kadar azalttığı bulundu. Farklı
konsantrasyonlardaki 5 farklı organik çözücünün enzim aktivitesine etkisi
sonuçlarında yabanıl tip CboFDH için aseton hariç etanol, metanol, propanol ve
kloroformun ortamki konsantrasyonları %50 olduğunda %52 oranında aktivite kaybı
gözlenirken; etanol, metanol, propanol de artan konsantrasyonlarda %20, kloroformda
ise %8 aktivite artışı gözlendi. Mutant enzimlerden Phe285ThrFDH enzimi için
etanol, metanol, propanol ve aseton organik çözücüleri artan konsantrasyonlarda
aktiviteyi %5-%21 aralığında arttırdığı ancak %50 konsantrasyonlarda %70'e kadar
aktiviteyi azalttığı gözlendi. Kloroformun ise artan konsantrasyonlara bağlı olarak
aktiviteyi %40 oranına kadar düşürdüğü bulundu. Val120ThrFDH enzimi için etanol,
metanol, propanol ve aseton organik çözücüleri artan konsantrasyonlarda aktiviteyi
%10-%24 aralığında arttırdığı ancak %50 konsantrasyonlarda %64 oranına kadar
aktiviteyi azalttığı gözlendi. Kloroformun ise artan konsantrasyonlara bağlı olarak
aktiviteyi %37 oranına kadar düşürdüğü bulundu. Gln287GluFDH enzimi için etanol,
metanol, propanol ve aseton organik çözücüleri artan konsantrasyonlarda aktiviteyi
%7-%31 aralığında arttırdığı ancak %50 konsantrasyonlarda %25 oranına kadar
aktiviteyi azalttığı gözlendi. Kloroformun ise artan konsantrasyonlara bağlı olarak
aktiviteyi %42 oranına kadar düşürdüğü bulundu. His311GlnFDH enzimi için etanol,
metanol, propanol ve aseton organik çözücüleri artan konsantrasyonlarda aktiviteyi
%6-%19 aralığında arttırdığı ancak %50 konsantrasyonlarda %33 oranına kadar
aktiviteyi azalttığı gözlendi. Kloroformun ise artan konsantrasyonlara bağlı olarak
aktiviteyi %49 oranına kadar düşürdüğü bulundu. Phe285Thr/His311GlnFDH enzimi
xix
: 21
Aralı
k
için etanol, metanol, propanol ve aseton organik çözücüleri artan konsantrasyonlarda
aktiviteyi %9-%29 aralığında arttırdığı ancak %50 konsantrasyonlarda %67 oranına
kadar aktiviteyi azalttığı gözlendi. Kloroformun ise artan konsantrasyonlara bağlı
olarak aktiviteyi %97 oranına kadar düşürdüğü bulundu.
Bu çalışma, bazı patolojik durumlardaki seviyeleri önemli bir belirteç olan formata
mutlak spesifik ayrıca endüstriyel kullanım alanları geniş NAD-bağımlı FDH
enziminin yerli ve büyük ölçekte üretilebilmesinde veri sağlaması açısından önemlidir.